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為什么要從化學發光轉換到熒光檢測

更新時間:2019-06-21點擊次數:1870

Western blot成像方法取決于二抗的標記物,常用的方法有基于酶促反應的化學發光法,基于熒光染料的可見熒光方法和紅外熒光方法,那么我們應該如何選擇呢?
*合適的Western blot實驗方法取決于您期望獲得哪些信息,也就是取決于您的實驗目的,小編比較了現有方法的優缺點,并分享了自己的心得,希望能夠幫助您選擇到*佳的實驗方法。

化學發光方法
化學發光western blot是相對容易且靈敏度*的檢測方法,靈敏度可以達到fg級。
適用于研究:通過電泳可輕松分離的分子量差異顯著的蛋白。

> 檢測單一蛋白
> 確定蛋白有無
> 檢測抗體反應
> 蛋白純度分析
> 檢測低豐度蛋白
 

優勢劣勢
靈敏度高半定量
實驗流程熟悉酶促反應
兼容膠片和數字成像系統一次只能檢測單一信號
 需要玻璃和重孵育
 膠片沒有過飽和提醒

 
熒光檢測方法
熒光染料分為可見熒光染料和紅外熒光染料,從而將熒光western blot檢測分為可見熒光檢測和紅外熒光檢測。目前可見熒光檢測*多三個通道,可以同時檢測三種不同的蛋白,近紅外檢測*多為兩個通道,一定選擇激光光源激發的哦,更接近近紅外染料的*大發射波長680nm和800nm,增強二抗信號,提高檢測的靈敏度。
熒光Western blot使用熒光染料標記的二抗進行檢測,膜上的靶標蛋白濃度與可見熒光信號強度呈線性關系,實現真實可靠的定量分析。熒光染料發射光譜不同,因此在一張印跡膜上可實現多重檢測。在無需剝離和重孵育條件下,進行上樣量質控,可以分析翻譯后修飾蛋白。
因此當您進行如下實驗室,選擇熒光檢測方法,妥妥的:

> 同時檢測多種蛋白
> 研究翻譯后修飾蛋白
> 同一印跡膜的上樣質控
> **定量western blot實驗
 

優勢劣勢
可進行多重檢測膜會有自發熒光
定量 
信號持久穩定 
實驗方法不需改變太多 

 
期刊雜志要求:
例如nature中“Image Integrity and Standards”中鼓勵在一張印跡膜上進行內參和目的蛋白的的檢測,同時使用合理的標準化方法:例如:全蛋白歸一化。


 
化學發光屬于酶促反應,動態范圍窄,只能實現定性分析,一次只能檢測一個信號,如要檢測多個信號,需要剝離和重孵育,如使用膠片成像,還需要反復摸索曝光時間,顯影定影設備和設備的維護,熒光檢測可同時滿足期刊雜志發表要求、一次可進行多個信號檢測,反應條件一致,jingzhun定量,特別近紅外熒光檢測方法,具有低背景,高信噪比,是現在western blot熒光定量的金標準。

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