色网址在线-色网址在线观看-色网综合-色翁荡息又大又硬又粗视频-色翁荡息又大又硬又粗又视频软件-色翁荡息又大又硬又粗又视频图片

服務(wù)咨詢熱線:

021-66030766

TECHNICAL ARTICLES

技術(shù)文章

當(dāng)前位置:首頁技術(shù)文章蛋白純化系統(tǒng)化常見問題總結(jié)

蛋白純化系統(tǒng)化常見問題總結(jié)

更新時(shí)間:2021-03-11點(diǎn)擊次數(shù):1172

使用Blupadstart蛋白純化系統(tǒng)過程中常遇見一些問題,這里整理了以下幾個(gè)蛋白純化實(shí)驗(yàn)中遇見的問題及其解決方案。
        1)我現(xiàn)在手頭有個(gè)融合蛋白,純化的時(shí)候用助溶劑溶解后做了GST親和層析,之后用蛋白酶切割后卻發(fā)現(xiàn)目的蛋白沒有活性。
請問有哪些可能會出現(xiàn)這種原因?怎么解決?測過基因序列,沒有問題。細(xì)胞破碎后,融合蛋白在沉淀里,我用助溶劑提取后,可以用GST做親和層析,但效率只有50%~60%左右。洗脫完融合蛋白不需要助溶劑,但這樣的條件下切割完后目的蛋白會沉淀,我用0.5%CHAPS助溶可勉強(qiáng)溶解部分,目的蛋白疏水性比較強(qiáng)。
       既然是疏水性很強(qiáng)你可以加點(diǎn)甘油或者乙二醇降低極性,這樣溶解就會好得多,此外你也直接加2%的PEG這樣也降低極性,同時(shí)保護(hù)你的蛋白,你再做純化就可以了,我以前遇到這樣的蛋白是用10%的乙醇加3-5%的PEG-5000,這樣的情況下蛋白還是活性回收率很高,我覺得那些表面活性劑能不用還是不用的好,你失去活性你可以監(jiān)測一下提取,純化,酶切到底哪里失去了活性,這樣更容易解決你的問題。還有注意緩沖液PH值,看看改變它對溶解度有沒有影響。蛋白有沉淀那你可以稍微把蛋白的濃度降低點(diǎn),這也是個(gè)辦法。
        2)請問有沒有合成過配體為FMN的親和膠?
        親和的填料合成過20來種,你是希望用它來純化某種脫氫酶嗎,我看FMN可偶聯(lián)的有限,倒是FAD有活潑的氨基好偶聯(lián),何況它們幾乎是同一個(gè)輔酶,你是不是考慮把FAD連上去。當(dāng)然FMN的結(jié)構(gòu)上也有個(gè)仲胺,可以偶聯(lián)到帶長手臂的環(huán)氧活化的填料上,而溴化氰活化或別的活化的介質(zhì)都不大好,因此我覺得這個(gè)沒有什么問題。   
       此外如果是以FMN為輔酶的,那我還可以建議你試試藍(lán)色瓊脂糖凝膠,因?yàn)樗呐浠慕Y(jié)構(gòu)和FMN的三個(gè)環(huán)很相似,它能純化不少脫氫酶和激酶。
相應(yīng)的偶聯(lián)的材料,要自己合成親和填料,有很多公司都提供活化好的介質(zhì),自己偶聯(lián)就可以,其中比較常用的有啟維益成公司的溴化氰瓊脂糖凝膠,環(huán)氧瓊脂糖凝膠,氨基瓊脂糖凝膠,羧基瓊脂糖凝膠,活化酯瓊脂糖凝膠,以及巰基瓊脂糖凝膠等,但是如果是小分子的配基*好選擇有3-10碳作為手臂的活化介質(zhì)為好,此外也曾經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)固定輔酶時(shí),偶聯(lián)位置不同,選擇性有差別,因此你可以選擇自己適合的活化介質(zhì)。
       不同的活化的介質(zhì)對偶聯(lián)的配基有不同的要求,所以要先對自己的配基有一個(gè)清楚的了解就可以選擇合適的活化介質(zhì)。
       我一般在合成的時(shí)候大多選擇環(huán)氧瓊脂糖凝膠,它能應(yīng)用的范圍廣氨基巰基羥基都可以,而且合成的介質(zhì)剛性好,非特異吸附少,所以不需要特殊處理未反應(yīng)基團(tuán)。此外鍵合的鍵很穩(wěn)定,配基脫落少。我覺得是不錯(cuò)的選擇。
       包涵體的蛋白復(fù)性做得不多,但是我記得有個(gè)哥們說*管用的辦法也是*簡單的方法,他說在復(fù)性的時(shí)候盡量別想什么太高難的技術(shù),那些時(shí)髦但不一定好用,常用的有透析復(fù)性,稀釋復(fù)性,包括國外的專家也這么說。我覺得有時(shí)候開始摸不出來未必就是方法不行,關(guān)鍵要經(jīng)常改變條件。
層析復(fù)性很時(shí)髦,但是真正能用的不是很多,我覺得蛋白這東西難就在于大多都不相同,所以關(guān)鍵要多看文獻(xiàn),多琢磨自己蛋白的特性,多嘗試。
       3)Sephadex G-25(medium)柱脫鹽時(shí),鹽濃度太高對柱效有影響嗎?若有,一般對鹽濃度限度如何?
       大家別客氣,除鹽對于濃度應(yīng)該也是有一定的限制的,同樣的樣品鹽濃度高的自然要比濃度低的要在柱子上走的峰要寬些,相對需要的柱子的分辨率也要高點(diǎn),但是在正常的范圍如1-2M應(yīng)該影響不大,不過要除得很干凈還是盡量少上點(diǎn)樣品,我覺得上樣的體積畢竟比濃度的影響更大。
       4)我的蛋白17kd左右,能跟肝素親和,一般用離子交換和親和層析純化,現(xiàn)在我用聚乙二醇修飾它,分子量增加5000左右,修飾率不可能達(dá)到100%,請問修飾后能用什么純化方法可以把修飾的和未經(jīng)修飾的分開?(當(dāng)然修飾后還殘留有聚乙二醇,這個(gè)小分子也要除掉)
        他們大多用凝膠過濾,我覺得這也不錯(cuò)的做法,畢竟PEG是鏈狀的分子,在柱子上和普通蛋白行為不一樣,修飾度越高那么出峰也越后,因此你的蛋白選擇sephadex G50試試,它的范圍在1000-30000,應(yīng)該是不錯(cuò)的選擇。此外PEG是個(gè)疏水性的鏈,修飾后的蛋白疏水性增強(qiáng),修飾度越高,疏水性越強(qiáng),可以用這個(gè)原理分離。離子交換也可以選擇,因?yàn)橥瑯拥览恚揎椂仍礁撸姾杀黄帘我苍蕉?,電荷也越少,因此?yīng)該修飾度越高越先出。親和也離子交換一樣的道理,你可以試試,你手頭的親和能不能分開,你在這幾個(gè)方法里選擇看哪個(gè)更經(jīng)濟(jì)好用就可以。
       5)我有個(gè)問題困繞很久,從**中提取酶,好像用常規(guī)的方法(超聲波破壁,緩沖液提取),總是拿不到我要的蛋白。是不是這種蛋白也是疏水性較強(qiáng),需要加助溶劑才能提取出來?另外,我是不是也可以加點(diǎn)甘油或者PEG來提取?
        其實(shí)這個(gè)問題我覺得是這樣的,既然你是提取那肯定是有沉淀和上清,你的目標(biāo)蛋白的分子量你是應(yīng)該知道的,那么跑電泳先看它到底是在上清還是沉淀里,剩下的問題你再解決如何提取。
對于不同的酶要看酶穩(wěn)定如何,你可以用不同的PH去提取,我曾經(jīng)提取一個(gè)酶用水就是提取不出來,需要用鹽才能提取出來,多試試,設(shè)計(jì)個(gè)方案,這樣才能解決問題,所以不一定加甘油就管用,你還得注意破碎本身會不會有問題,倒回去做做也許能找到真正的原因。有什么問題繼續(xù)探討。
        6)HPLC是用來分析檢測或分離純化?
        如果可以用來純化,上樣量那么小有什么意義呢?
        如果是用來分析檢測,怎樣指導(dǎo)以后的分離純化工作呢?
        HPLC既可以做分析也可以做制備,純化上樣量小,這樣分離效果好,就可能得到很純的物質(zhì),同時(shí)配合質(zhì)譜等就可以得到很多單一蛋白的特性包括序列等,這些純度高的組分是用一般的純化方法做不到的。HPLC重現(xiàn)性好,定量準(zhǔn)確,所以也可以用于定量和定性,是分析中*的工具。
分析出來后如果這個(gè)物質(zhì)很穩(wěn)定,直接線性放大就可以做大規(guī)模的制備,因此摸好了分析的條件也就相應(yīng)有了制備的條件。

上一個(gè):凝膠成像分析系統(tǒng)為什么一般采用自動變焦鏡頭

返回列表

下一個(gè):凝膠成像的種類該如何選擇

欧美丰满老熟妇aaaa片 | 成品人视频ww入口 | 亚洲av无码之国产精品网址蜜芽 | 国产乱人对白 | 婷婷四虎东京热无码群交双飞视频 | 乱码1乱码2美美哒 | 天天躁日日躁狠狠躁欧美老妇小说 | 成人午夜福利视频后入 | 99国产精品久久久久久久成人热 | 亚欧中文字幕久久精品无码 | 国产精品白浆在线观看免费 | 国产私拍福利精品视频推出 | 高h纯肉无码视频在线观看 天天碰免费上传视频 | 国产av一区二区三区 | 免费a级毛片无码免费视频120软件 | 免费高清成人啪啪网站 | 亚洲精品午睡沙发系列 | 亚洲人成77777在线播放网站 | 国产国拍亚洲精品永久软件 | 日韩av无码一区二区三区不卡 | 国产精品久久久久久久久久妞妞 | 丰满人妻一区二区三区免费视频 | 美女把尿囗扒开让男人添 | 久碰人妻人妻人妻人妻人掠 | 久久久久无码精品亚洲日韩 | 成人伊人精品色xxxx视频 | 国产女女精品视频久热视频 | 免费人成网站在线观看欧美 | 女人国产香蕉久久精品 | 国产精品久久一区二区三区 | 国产成人无码精品久久久露脸 | 高清在线一区二区三区亚洲综合 | 国产综合无码一区二区辣椒 | 人妻少妇精品无码专区二区 | 欧美性猛交xxxx免费看蜜桃 | 红桃av一区二区三区在线无码av | 天天躁日日躁狠狠躁av | 久久国产精品久久 | 欧美精品videossex少妇 | 两口子交换真实刺激高潮 | 亚洲一区二区三区国产精华液 |